Diédit ku Peter Sarnow, Sakola Kedokteran Universitas Stanford, Universitas Stanford, California, disatujuan tanggal 25 Désémber 2020 (ditinjau tanggal 25 Oktober 2020)
Kami ngalaporkeun interaksi antara subunit dina réplikasi kompleks transkripsi coronaviruses, anu penting pikeun réplikasi sareng konservasi évolusionér.Kami nyayogikeun bukti yén domain NiRAN anu aya hubunganana sareng nsp12 gaduh kagiatan transferase nucleoside monofosfat (NMP) dina trans, sareng ngaidentipikasi nsp9 (protein beungkeutan RNA) salaku udaganana.NiRAN ngatalisan kantétan kovalén bagian NMP kana terminal amino nsp9 anu dilestarikan dina réaksi anu ngandelkeun ion Mn2+ jeung résidu Asn anu dikonservasi padeukeut.Kapanggih yén kagiatan NiRAN sareng nsp9 NMPylation penting pikeun réplikasi coronavirus.Data ngamungkinkeun urang pikeun ngaitkeun kagiatan ieu tina spidol énzim virus nested kana observasi saméméhna dina hipotésis yén inisiasi sintésis RNA dina kelas virus RNA sacara fungsional jeung évolusionér konsisten.
RNA-dependent RNA polymerase (RdRps) of Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, jeung 12 famili séjén) numbu ka domain amino-terminal (N-terminal) dina protéin non-struktural (nsp) nu dileupaskeun tina poliprotein, disebut NiRAN. 1ab diwangun ku protease utama virus (Mpro).Saméméhna, virus arteri NiRAN-RdRp nsp sorangan aktivitas GMPylation / UMPylation dilaporkeun, sarta eta disarankeun pikeun ngahasilkeun transient pikeun mindahkeun nucleoside monofosfat (NMP) kana virus (ayeuna kanyahoan) jeung / atawa sél biopolymerization Things.Di dieu, kami nunjukkeun yén coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E sareng Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ngagaduhan aktivitas NMPylation Mn2+-dependent, anu diturunkeun tina nsp9 ngaliwatan formasi nsp9 anu dimédiasi Mpro. N-terminal flanking nsps dileupaskeun sacara proteolitik, fosforamidat kabeungkeut kana amina primér (N3825) dina N-terminal nsp9.Uridin trifosfat mangrupikeun nukléotida anu dipikaresep dina réaksi ieu, tapi adénosin trifosfat, guanosin trifosfat, sareng sitidin trifosfat ogé cocog sareng substrat.Studi mutasi ngagunakeun protéin coronavirus nsp9 sareng nsp12 rékombinan sareng mutan HCoV-229E anu direkayasa sacara genetik nangtukeun résidu anu dipikabutuh pikeun nsp9 NMPylation anu dimédiasi NiRAN sareng réplikasi virus dina kultur sél.Data dikonfirmasi prediksi résidu situs aktip NiRAN sarta nangtukeun peran penting résidu nsp9 N3826 dina nsp9 NMPylation sarta réplikasi virus in vitro.Résidu ieu mangrupikeun bagian tina sékuen tripéptida N-terminal NNE anu dilestarikan sareng kabuktosan janten hiji-hijina résidu invarian tina nsp9 sareng homolog na dina kulawarga coronavirus.Ulikan ieu nyadiakeun yayasan padet pikeun ulikan fungsional aktivitas NMPylation virus nested séjén sarta proposes mungkin target pikeun ngembangkeun ubar antiviral.
Virus RNA terdampar positif Nidovirales nginféksi rupa-rupa vertebrata sareng invertebrata (1, 2).Paréntah ayeuna kalebet 14 kulawarga (3), dimana kulawarga Coronavirus parantos ditaliti sacara éksténsif dina 20 taun katukang.Dina waktos éta, tilu coronaviruses zoonotic muncul tina host sato sareng nyababkeun wabah ageung inféksi pernapasan parah dina manusa.Kaasup pandémik pengkuh disababkeun ku kasakit tepa akut parna.Sindrom Pernafasan Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruses babagi organisasi génom umum, sarta subunit tina mémbran-bound réplikasi-transkripsi kompléks (RTC) disandikeun dina 5-?²-terminal dua per tilu jeung subunit struktural utama partikel virus, kitu ogé sababaraha asesoris. .Protéin, disandikeun dina 3??² tungtung katilu génom (1).Iwal hiji kulawarga virus planarian (Monoviridae) (8), kabéh virus nested encode subunit RTC dina dua pigura bacaan kabuka badag (ORF) ORF1a jeung ORF1b, nu ditarjamahkeun tina RNA génomik tina.ORF1a ngodekeun poliprotein (pp) 1a, sareng ORF1a sareng ORF1b babarengan encode pp1ab.Kalayan partisipasi umum tina protease utama (Mpro) disandi ku ORF1a, duanana pp1a sareng pp1ab diolah sacara proteolitik jadi rupa-rupa protéin non-struktural (nsps), ogé katelah 3CLpro, sabab gaduh homologi sareng 3Cpro tina picornavirus ( 9).nsps ieu disangka dirakit kana RTC dinamis badag, ngatalisan sintésis RNA génomik (réplikasi) jeung susunan RNA subgénomic (transkripsi), sarta dipaké pikeun koordinat ekspresi ORF lokasina hilir ORF1b (10? ? ?12).
Inti RTC kalebet RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helikase (HEL1) (14, 15) sareng sababaraha énzim pamrosésan RNA, anu utamina disandikeun dina ORF1b sareng dina kulawarga coronavirus Ieu ngandung nsp12-nsp16 sareng nsp9-nsp12 dina kulawarga Arterioviridae (tingali rujukan 10ââ 12).RdRp sareng HEL1 ngagambarkeun dua (saperlima) domain anu dilestarikan tina virus sarang manuk sareng gaduh homologi diantara virus RNA anu sanés.Réplika inti dipercaya dibantuan ku subunit séjén, kaasup sababaraha nsps leutik dileupaskeun tina wewengkon carboxy-terminal (terminal C) pp1a, hilir Mpro (coronavirus nsp5 jeung virus arteri nsp4, masing-masing).Aranjeunna gaduh panyalindungan khusus pikeun kulawarga sareng kagiatan anu rupa-rupa (diulas dina rujukan 10ââ12).
Relatip anyar-anyar ieu, hiji domain kalawan ciri motif runtuyan unik kapanggih dina terminal amino (N-terminus) padeukeut RdRp dina sakabéh virus nested, tapi euweuh virus RNA séjén (16).Dumasar kana lokasina sareng kagiatan nukléotida transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), domain ieu dingaranan NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Kombinasi dual-domain NiRAN-RdRp mangrupakeun nsp12 dina kulawarga Coronaviridae sareng nsp9 dina kulawarga Arterioviridae, sareng dina nestoviridae anu sanés, NiRAN-RdRp diperkirakeun dileupaskeun salaku nsp mandiri tina poliprotein virus.Dina coronavirus, domain NiRAN ngandung ??1/450 résidu sareng disambungkeun ka domain RdRp terminal-C ngaliwatan wilayah linker (16?19).Dina Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), rekombinan nsp9 nembongkeun Mn2 + ion-gumantung (diri) UMPylation jeung kagiatan GMPylation, nu gumantung kana tilu basa runtuyan conserved di nestovirus, AN, BN jeung CN The résidu dina runtuyan.Dimana N nangtung pikeun NiRAN) (16).Sisi N-terminal tina motif ieu mangrupikeun motif preAN anu kirang konservatif.Sababaraha résidu ieu ogé dilestarikan dina kinase protéin anu aya hubunganana jauh, dimana aranjeunna parantos kabuktian aub dina beungkeutan nukléosida trifosfat (NTP) sareng kagiatan katalitik (20, 21).Saluyu sareng observasi ieu, sababaraha résidu situs aktif konci dina pseudokinase SelO ti Pseudomonas syringae tiasa dirakit sareng superkompléks SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 anu nembé diterbitkeun.Résidu NiRAN Coronavirus anu disimpen ditumpangkeun dina struktur mikro éléktron.Protéin rékombinan (17).Hal ieu ngaduga yén documented (diri) U / GMPylation bakal ngahasilkeun kaayaan fana pikeun mindahkeun NMP kana substrat (ayeuna kanyahoan) (16), sarta kasaruaan struktural antara NiRAN jeung protéin kinase (17, 19) ) Nyaéta hipotésis yén NiRAN ngarobah protéin séjén.
Seueur fitur, kalebet asosiasi sistematis unik sareng unik sareng virus bersarang sareng pamisahan genetik tina RdRp, ngajantenkeun NiRAN janten énzim pangaturan konci anu wajar pikeun virus bersarang, anu penting pikeun mecenghulna sareng identitasna.Saméméhna, tilu fungsi anu mungkin ngalibetkeun NiRAN pikeun ngatur tarjamahan génom/subgénomik atawa réplikasi/transkripsi disebut.Nalika nganggap data anu langka sareng teu lengkep anu aya dina waktos éta, unggal fungsi ngagaduhan kaunggulan sareng kalemahan (16).Dina ieu panalungtikan, urang boga tujuan pikeun ngagabungkeun studi genetik biokimia jeung sabalikna tina coronaviruses ngalambangkeun dua genera, sarta nempatkeun papanggihan urang dina kasang tukang évolusionér mutasi alam kulawarga coronavirus, ku kituna meunang wawasan ngeunaan alam Misterius ieu.Urang ngalaporkeun kamajuan utama dina pamahaman NiRAN ngaliwatan idéntifikasi target alam di RTC, nu (di antara tilu hipotesis sadia) nyumbang kana peran domain ieu dina initiating sintésis RNA virus nested.Panaliti ieu ogé muka kamungkinan pikeun peran NiRAN sanés dina antarmuka host virus.
Pikeun ngacirian sipat énzimatik domain NiRAN anu aya hubunganana sareng virus korona nsp12, kami ngahasilkeun bentuk rékombinan tina coronavirus manusa 229E (HCoV-229E) nsp12 dina E. coli, kalayan tag His6 di terminal C, sareng ngagabungkeun protéin jeung [α32-P ] Inkubasi babarengan jeung NTP ku ayana MnCl2 sakumaha ditétélakeun dina Bahan jeung Métode.Analisis produk réaksi nunjukkeun ayana protéin radiolabeled co-migrasi sareng nsp12 (106 kDa), nunjukkeun yén coronavirus nsp12 ngatalisan formasi kovalén protéin-NMP adducts, preferentially dibentuk ku uridine monofosfat (UMP) (Gambar 1A) Jeung B).Analisis kuantitatif némbongkeun yén dibandingkeun jeung nukléotida séjén, inténsitas sinyal incorporation UMP ngaronjat ku 2 nepi ka 3 kali (Gambar 1C).Data ieu konsisten sareng kagiatan transferase NMP anu diprediksi tina domain NiRAN tina coronavirus (16), tapi nunjukkeun yén preferensi nukléotida tina domain NiRAN tina coronavirus sareng virus arteri béda.
Kagiatan NMPilasi diri HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) diinkubasi sareng [α-32P] NTP anu ditunjuk ku ayana 6 mM MnCl2 salami 30 menit (tingali Bahan sareng Métode pikeun detil).Produk réaksi dipisahkeun ku SDS-PAGE sareng diwarnaan ku Coomassie biru cemerlang.(B) Protéin radiolabeled divisualisasikeun ku pencitraan fosfor.Posisi nsp12-His6 jeung spidol massa molekular protéin (dina kilodaltons) ditémbongkeun dina A jeung B. (C) Inténsitas sinyal radioaktif (mean ± SEM) ditangtukeun ti tilu percobaan bebas.*P≤0.05.Kakuatan sinyal (persentase) aya hubunganana sareng UTP.
Sanaos kagiatan énzim anu aya hubunganana sareng NiRAN parantos kabuktian penting pikeun réplikasi EAV sareng SARS-CoV dina kultur sél (16), fungsi NiRAN khusus sareng target poténsial henteu acan ditangtukeun.Kasaruaan struktural anu nembé dilaporkeun antara NiRAN sareng kulawarga protéin kalayan lipatan sapertos protéin kinase (17, 22) nyababkeun urang pikeun nguji hipotésis yén NiRAN ngatalisan NMPylation protéin séjén.Kami ngahasilkeun sakumpulan target homolog poténsial, kalebet protéin non-struktural anu disandi ku HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), masing-masing ngandung tag His6 terminal C (lampiran SI, Tabel S1), sareng inkubasi protéin ieu kalawan [α32-P] uridin trifosfat ([α32-P]UTP) dina ayana atawa henteuna nsp12.Bovine sérum albumin jeung MBP-LacZα protéin fusi dihasilkeun dina E. coli dilayanan salaku kadali (Gambar 2A, jalur 1 nepi ka 7).Protéin radiolabeled dianalisis ku natrium dodecyl sulfate-polyacrylamide gél éléktroforésis (SDS-PAGE) jeung autoradiography, sarta kapanggih yén aya sinyal radioaktif kuat dina réaksi nu ngandung nsp12 na nsp9.Posisi sinyal pakait jeung massa molekular nsp9, nunjukkeun nsp12-dimédiasi UMPylation of nsp9 (Gambar 2B, lagu 7).Teu aya protéin tés anu sanés anu kapanggih UMPylated, anu nyababkeun urang nyimpulkeun yén nsp9 mangrupikeun substrat khusus tina nsp12.Konsisten jeung data timer NMPylation ditémbongkeun dina Gambar 1, nsp12 téh bisa nransper sadayana opat NMP ka nsp9, sanajan efisiensi béda, UMP> adénosin monofosfat (AMP)> guanosin monofosfat (GMP)> cytidine monofosfat (CMP) ) ( Gambar).3 A jeung B).Dina kaayaan anu digunakeun dina assay ieu (singgetan réaksi sareng waktos paparan, ngirangan konsentrasi nsp12; bahan sareng metode), NMPylation diri nsp12 henteu tiasa dideteksi (bandingkeun Gambar 2B, jalur 7, sareng Gambar 1B), anu dibuktikeun hiji éféktif (Jeung sababaraha rounds) UMP dipindahkeun ti nsp12 mun nsp9.Kagiatan transferase UMP merlukeun ayana ion Mn2+, sakumaha ditémbongkeun dina Gambar 3C, sedengkeun ngan aktivitas transferase UMP minimal anu dititénan ku ayana Mg2+, sarta euweuh aktivitas dina ayana dua kation divalen séjén diuji.Data anu sami dicandak dina uji NMPylation anu ngandung cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), sareng adénosin triphosphate (ATP) (SI appendix, Gambar S1).
HCoV-229E nsp12-dimédiasi UMPylation of nsp9.Runtuyan substrat protéin (kaasup albumin sérum sapi, MBP-lacZα, sareng séri HCoV-229E nsps dilabélan ku C-terminal His6 disandi ku ORF1a) digunakeun pikeun ngévaluasi kagiatan UMPylation HCoV-229E nsp12-His6⁺-dimédiasi. protéin.Inkubasi protéin kalawan [α-32P] UTP salila 10 menit dina henteuna (A) atawa ayana (B) nsp12 sakumaha dijelaskeun dina bahan jeung métode.Di luhureun A jeung B, SDS-polyacrylamide gél patri ku Coomassie Brilliant Blue ditémbongkeun, sarta di handap A jeung B, autoradiograms pakait ditémbongkeun.Posisi spidol massa molekular protéin (dina kilodaltons) dibere di kénca.Posisi nsp12-His6 (B, luhur) sareng sinyal radioaktif anu dititénan nalika inkubasi nsp12-His6 sareng nsp9-His6 (B, jalur 7) ogé dituduhkeun, anu nunjukkeun yén [α-32P]UMP ka nsp9-His6 (12.9 kDa), anu henteu dititénan pikeun protéin anu diuji.
HCoV-229E NiRAN-dimédiasi biokimia sareng karakterisasi virologis nsp9 NMPylation.(A jeung B) Peran nukléotida ko-substrat dipaké dina réaksi.Nsp12-His6 sareng nsp9-His6 dicampur sareng diinkubasi ku ayana NTPs [α-32P] anu béda dina tés NMPylation standar.(A, luhur) Coomassie-stained nsp9-His6 dipisahkeun ku SDS-PAGE.(A, handap) Autoradiograph wewengkon sarua gél.(B) Kagiatan relatif (hartosna ± SEM) ku ayana kofaktor nukléotida ditunjuk ditangtukeun tina tilu percobaan bebas.*P≤0.05.(C) Peran ion logam.Ditémbongkeun téh tés NMPylation baku ku ayana [α-32P] UTP jeung ion logam béda, unggal kalawan konsentrasi 1 mM.Dina C, luhureun, Coomassie patri nsp9-His6 ditémbongkeun, sarta dina C, handap, autoradiography pakait ditémbongkeun.Ukuran protéin anu dilabélan (dina kilodalton) dipidangkeun di kénca A jeung C. (D) Bentuk mutant HCoV-229E nsp12-His6 mawa substitusi asam amino anu ditangtukeun aya dina [α-32P]UTP, sakumaha ditétélakeun. dina Bahan jeung Métode.Radiolabeled nsp9-His6 dihasilkeun dina réaksi NMPylation dideteksi ku pencitraan fosforilasi (D, luhur).Kagiatan relatif dibandingkeun jeung tipe liar (wt) protéin ditémbongkeun dina D, sarta handap dicokot rata-rata (± SEM) tina tilu percobaan Independent.Tanda bintang nunjukkeun substitusi résidu non-konservasi.(E) Titer virus dina supernatan kultur sél p1 diala 24 jam saatos inféksi ditangtukeun ku assay plak.Substitusi kodon dina domain NiRAN tina mutan HCoV-229E anu direkayasa dituduhkeun (panomeran sésa dumasar kana posisina dina pp1ab).The réplikasi-kakurangan RdRp situs aktip mutant nsp12_DD4823 / 4AA ieu dipaké salaku kontrol a.
Pikeun kéngingkeun pamahaman anu langkung jero ngeunaan situs aktif NiRAN sareng nangtoskeun résidu anu aya hubunganana sareng kagiatan transferase NMP nsp9-spésifik, kami ngalaksanakeun analisa mutasi, dimana urang ngagentos résidu konservatif dina motif NiRAN AN, BN sareng CN ( 16) Éta Ala (lampiran SI, Gambar S2).Salaku tambahan, dampak substitusi Arg-to-Lys atanapi Lys-to-Arg konservatif dievaluasi dina dua kasus.Salaku kontrol (négatip), résidu anu henteu atanapi kirang dilestarikan dina domain NiRAN coronaviruses sareng virus nested sanésna diganti ku Ala. Ngaganti K4116A (dina motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif). BN) sareng D4280A (CN) sacara signifikan ngirangan atanapi malah ngaleungitkeun nsp9 NMPylation ngaliwatan nsp12, sedengkeun protéin kalayan substitusi konservatif (R4178K), K4116R) nahan 60% sareng 80% tina kagiatanana, anu nunjukkeun yén rélaxasi larangan dina sisi masing-masing. ranté téh physicochemically sénsitip (Gambar 3D).Ngaganti sababaraha résidu konservasi séjén E4145A, D4273A, F4281A na D4283A loba kirang ngabahayakeun, sarta nsp9 UMPylation ngan moderately ngurangan.Hasil anu sami dicandak dina réaksi NMPylation nsp9 anu ngalibetkeun NTP sanés (Gambar 3D sareng lampiran SI, Gambar S3), mastikeun yén épék anu dititénan dina substitusi asam amino khusus henteu gumantung kana jinis substrat ko-substrat nukléotida anu dianggo.Salajengna, urang nguji kamungkinan dampak tina substitusi nsp12 ieu dina réplikasi koronavirus dina budaya sél.Pikeun tujuan ieu, kami nganggo témplat DNA komplementer (cDNA) rékayasa genetik anu cocog anu diklon dina virus vaccinia rekombinan (23, 24) pikeun nranskripsikeun 5 -7 sél.Titrasi turunan virus tepa anu dihasilkeun dina sél ieu nunjukkeun yén kalolobaan mutan HCoV-229E NiRAN henteu tiasa dilaksanakeun (Gambar 3E).Grup mutan viral non-giat kaasup alternatif anu geus ditémbongkeun pikeun ngaleungitkeun atawa nyata ngurangan aktivitas transferase in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), tapi aya dua alternatif séjén (K4116R, E4145A) 80 % ditangtayungan?Aktivitas in vitro NMPylation maranéhanana nunjukkeun yén aya larangan tambahan.Nya kitu, dua mutasi séjén (R4178K, F4281A) anu nyababkeun panurunan sedeng dina aktivitas NMPylation in vitro NiRAN ngahasilkeun virus hirup, kumaha oge, virus ieu sacara signifikan ngurangan titer ngaliwatan réplikasi.Konsisten jeung data aktivitas in vitro ditémbongkeun dina Gambar 3D, ngagantikeun opat résidu séjén nu teu dilestarikan dina coronavirus jeung/atawa virus nested séjén (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ngahasilkeun virus giat The turunan, sanajan ngabogaan a titer moderately ngurangan dibandingkeun jeung virus tipe liar (Gambar 3E).
Pikeun nalungtik naha kagiatan transferase NMP anu dimédiasi NiRAN gumantung kana domain RdRp aktip, dua résidu Asp anu dilestarikan aub dina koordinasi ion logam divalen (11) dina RdRp motif C diganti ku Ala. Protéin anu dihasilkeun nsp12_DD4823/4AA nahan. aktivitas NMPylation nsp9 na, nunjukkeun yén nsp12-dimédiasi dina vitro nsp9 aktivitas NMPylation teu merlukeun aktivitas polymerase (SI Appendix, Gambar S4).
Saatos netepkeun kagiatan transferase NMP-nsp9-spésifik pikeun nsp12, urang nyobian ngacirian adduct NMP-nsp9 ku spéktrométri massa (MS).Spéktrum massa protéin lengkep HCoV-229E nsp9 rékombinan némbongkeun puncakna dina 12.045 Da (Gambar 4A).Penambahan nsp12 henteu ngarobih kualitas nsp9, nunjukkeun yén nsp12 sareng nsp9 moal ngabentuk kompleks anu stabil dina kaayaan anu dianggo (denaturasi) (Gambar 4A).Ku ayana UTP jeung GTP, ukuran massa réaksi nu ngandung nsp9 jeung nsp12 masing-masing némbongkeun yén massa protéin UTP pindah 306 Da, jeung massa protéin GTP pindah 345 Da, nunjukkeun yén unggal molekul nsp9 ngiket hiji UMP atawa GMP. (Gambar 4) C jeung D).Diperkirakeun yén énergi anu diperyogikeun pikeun nsp9 NMPylation anu dimédiasi NiRAN asalna tina hidrolisis NTP sareng pelepasan pirofosfat.Sanajan kaleuwihan molar 10-melu tina nsp9 (target) ti nsp12 (énzim) dipaké dina réaksi ieu, ampir lengkep NMPylation of nsp9 ieu observasi, nunjukkeun yén interaksi antara nsp12 na nsp9 nyaeta pondok-cicing, sarta nsp12 bisa NMPylate langkung nsp9. molekul in vitro.
NMPylation tunggal nsp9 ku ayana nsp12 sareng UTP atanapi GTP.Ditémbongkeun nyaéta spéktrum massa protéin lengkep deconvoluted HCoV-229E nsp9 (SI lampiran, Tabél S1) (AD).(A) nsp9 nyalira, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 ku ayana UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 ku ayana GTP.
Pikeun nangtukeun résidu nsp9 UMPylated ku nsp12, nsp9-UMP ieu dibeulah ku trypsin.Péptida nu dihasilkeun dipisahkeun ku nano-high performance liquid chromatography (HPLC) jeung dianalisis ku tandem mass spectrometry (MS/MS) online.Analisis data ngagunakeun pakét software Byonic (Protéin Métrics) némbongkeun UMPylation asam amino N-terminal.Ieu dikonfirmasi sacara manual.Spéktrum massa tandem péptida prékursor [UMP] NNEIMPGK (SI lampiran, Gambar S5A) ngungkabkeun sempalan dina 421 m / z, nunjukkeun yén UMP ngiket résidu 1 tina nsp9.
Dina N-terminus nsp9, Asn dilestarikan diantara anggota Orthocoronavirinae (SI lampiran, Gambar S6).Sanajan urang yakin yén N-terminal primér amina nitrogén nyaéta akséptor paling dipikaresep pikeun UMP, urang mutuskeun pikeun ménta bukti tambahan ngeunaan NMP mengikat di N-terminal.Ku sabab kitu, non-NMPylated na NMPylated N-terminal péptida nsp9 dimurnikeun ku HPLC ieu diturunkeun ku ayana acetone jeung natrium sianoborohidrida.Dina kaayaan ieu, ngan amina primér bébas bisa dirobah ku propil (25).Péptida N-terminal nsp9-turunan kalawan runtuyan NNEIMPGK ngandung dua amina primér, hiji di N-terminus Asn jeung lianna di ranté samping Lys dina C-terminus.Ku alatan éta, grup propil bisa diwanohkeun dina duanana tungtung.Kromatogram ion ékstraksi péptida non-NMPylated dipidangkeun dina lampiran SI, Gambar S5B.Saperti nu diharapkeun, N-terminal jeung C-terminal (mono) propylated (SI lampiran, Gambar S5B, jalur luhur) jeung péptida dipropylated (SI appendix, Gambar S5B, jalur handap) bisa dicirikeun.Pola ieu robih kalayan ngagunakeun péptida terminal N NMPylated tina nsp9.Dina hal ieu, ngan péptida propilated C-terminal bisa dicirikeun, tapi péptida propilated N-terminal jeung péptida dipropylated teu dicirikeun (SI Appendix, Gambar S5C), nunjukkeun yén UMP geus dialihkeun ka amin primér N-terminal Pikeun nyegah ieu. grup tina nyieun parobahan.
Salajengna, urang ngaganti (kalawan Ala atawa Ser) atawa mupus résidu conserved di N-terminus of nsp9 keur ngartikeun konstrain target-spésifik.Dumasar data MS kami nunjukkeun yén NiRAN ngabentuk adduct nsp9-NMP sareng amina primér résidu N-terminal nsp9, kami hipotésis yén nsp9 NMPylation merlukeun master protease viral (Mpro, nsp5) pikeun ngaleupaskeun nsp9 N-terminal tina. prékursor polyprotein na.Pikeun nguji hipotésis ieu, kami ngahasilkeun protéin prékursor nsp7-11 anu ngandung nsp9 dina E. coli sareng ngalaksanakeun tés NMPylation standar ku ayana [α-32P] UTP (bahan sareng metode).Ditémbongkeun saperti dina Gambar 5A (jalur 3), nu uncut nsp7-11 prékursor teu radiolabeled kalawan nsp12.Kontras, lamun nsp7-11 dibeulah ku rékombinan nsp5 pikeun ngaleupaskeun nsp9 (jeung nsps séjén) ti prékursor, protéin radiolabeled nu migrasi jeung nsp9 dideteksi, confirming kacindekan urang yen NiRAN jeung N- Selektif formasi kovalén nsp9-NMP adducts. .Amina primér terminal N-terminal Asn (posisi 3825 dina pp1a/pp1ab).Kacindekan ieu ogé dirojong ku ékspérimén ngagunakeun konstruk nsp9, anu ngandung hiji atawa dua résidu tambahan dina N-terminus.Dina duanana kasus, UMPylation NSP9-dimédiasi NiRAN dileungitkeun (SI Appendix, Gambar S7).Salajengna, urang ngahasilkeun protéin kalayan hiji atawa dua résidu Asn dihapus tina runtuyan péptida 3825-NNEIMPK-3832 di N-terminal nsp9.Dina duanana kasus, nsp9 UMPylation sagemblengna diblokir (Gambar 5B), nyadiakeun bukti tambahan yén nsp9 N-terminus nyata tindakan minangka hiji reséptor NMP.
Ngolah proteolitik of nsp9 jeung peran résidu N-terminal dina nsp12-dimédiasi UMPylation.(A) nsp9 UMPylation merlukeun nsp9 N-terminal bébas.Nsp7-11-His6 tos diinkubasi dina 30 °C dina panyangga deteksi NMPylation anu ngandung UTP ku ayana atanapi henteuna rékombinan Mpro (nsp5-His6).Saatos 3 jam, mimitian assay NMPylation ku nambahkeun nsp12-His6 sakumaha dijelaskeun dina Bahan jeung Métode.Réaksi anu ngandung nsp5-His6 (jalur 1) sareng nsp9-His6 (jalur 2) dianggo salaku kontrol.Saatos 10 menit, réaksina ditungtungan sareng campuran réaksi dipisahkeun ku SDS-PAGE.Protéin diwarnaan ku Coomassie Brilliant Blue (A, luhur).prékursor Nsp7-11-His6 jeung produk olahan hasil tina belahan dimédiasi nsp5-His6 ditémbongkeun di katuhu.Punten dicatet (kusabab ukuranana leutik) yén nsp7 sareng nsp11-His6 henteu tiasa didéteksi dina gél ieu, sareng réaksina ditambahan ku nsp5-His6 (jalur 1 sareng 4; posisi nsp5-His6 dituduhkeun ku bunderan padet) atanapi nsp9-His6 (Jalur 2) ngandung sajumlah leutik MBP (ditunjukkeun ku bunderan kabuka) salaku rereged residual sabab dinyatakeun salaku protéin fusi MBP (lampiran SI, Méja S1).(B) varian Nsp9-His6 lacks hiji atawa dua N-terminal résidu Asn (residu panomeran nurutkeun posisi di pp1a / pp1ab) sarta dimurnikeun tur incubated kalawan nsp12-His6 na [α-32P] UTP.B, SDS-kaca patri ku Coomassie ditémbongkeun di luhur, B, autoradiograph pakait ditémbongkeun di handap.Posisi spidol beurat molekular (dina kilodaltons) ditémbongkeun di kénca.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal résidu konservasi diganti ku Ala atawa Ser, sarta jumlah protéin anu sarua dipaké dina nsp12-His6 dimédiasi réaksi UMPylation.Produk réaksina dipisahkeun ku SDS-PAGE sareng diwarnaan ku Coomassie Brilliant Blue (C, top), sareng radiolabeled nsp9-His6 dideteksi ku pencitraan phosphorescence (C, tengah).Ngagunakeun protéin tipe liar (wt) salaku rujukan (disetel ka 100%), aktivitas NMPylation relatif (hartosna ± SEM) diitung tina tilu percobaan bebas.(D) Titer virus dina supernatan kultur sél p1 sél Huh-7 anu kainfeksi sél HCoV-229E tipe liar Huh-7, sareng mutan anu mawa substitusi asam amino anu ditunjuk dina nsp9 ditangtukeun ku uji plak.Réplikasi-kakurangan RdRp motif C ganda mutant DD4823/4AA dipaké salaku kontrol négatip.
N-terminus nsp9 (utamana posisi 1, 2, 3, jeung 6) pisan dilestarikan diantara anggota subfamili Orthocoronavirinae (SI lampiran, Gambar S6).Dina raraga diajar kamungkinan peran résidu ieu dina nsp12-dimédiasi nsp9 NMPylation, dua résidu Asn padeukeut di N-terminus of nsp9 diganti ku Ala atanapi Ser (nyalira atawa dina kombinasi).Dibandingkeun sareng liar-tipe nsp9, ngaganti N3825 kalawan Ala atanapi Ser nyababkeun leuwih ti hiji réduksi dua kali dina UMPylation nsp12-dimédiasi (Gambar 5C).Konsisten jeung kacindekan urang yén NMPylation lumangsung dina amina primér N-terminal tinimbang ranté samping tina résidu N-terminal, urang observasi residual NMPylation signifikan jeung ngagantian N3825A na N3825S.Narikna, lamun Asn kadua diganti ku Ala atawa Ser, nsp9 UMPylation ngurangan leuwih kuat (leuwih ti 10 kali), sedengkeun ngagantian Ala dina posisi 3, 4, jeung 6 ngan boga pangaruh sedeng on nsp9 UMPylation (Gambar 2). ).5C).Hasil anu sami dicandak nganggo ATP, CTP atanapi GTP (SI lampiran, Gambar S8).Sacara koléktif, data ieu nunjukkeun peran konci N2826 (posisi 2 dina nsp9) dina nsp9 NMPylation.
Pikeun kéngingkeun bukti tambahan ngeunaan korelasi fungsional antara N-terminus nsp9 sareng NMPylation, kami ngalaksanakeun sababaraha alignment sekuen (MSA) tina sekuen nsp9 kulawarga Coronavirus (variasi antara 104 sareng 113 résidu) (SI Appendix, Gambar. S6).Dina total, dina 47 spésiés (dipikawanoh tur diduga) tina 5 genera subfamili Orthocoronavirinae nu nginféksi mamalia béda, manuk, jeung sarwa reptil, ngan 8 résidu dina total kapanggih invarian.Parobahan paling éksténsif, kaasup ngahapus jeung insertions, anu dititénan dina siklus antara elemen struktur sekundér nsp9, sakumaha ditangtukeun ku studi struktural saméméhna (26 ??28).Lima résidu invarian kapanggih dina untaian β jeung α héliks bagian C-terminal nsp9.Tilu résidu invarian mangrupakeun motif NNE tina N terminal nsp9.Diungkabkeun yén Asn kadua motif ieu mangrupikeun hiji-hijina résidu invarian, anu ogé dibagi ku nsp9 hipotétis tina coronavirus bangkong anu aya hubunganana, sareng ngagambarkeun spésiés Microhyla letovirus 1 dina subfamili Letovirinae of Alphaletovirus.Konservasi résidu dina nsp9 elemen struktur sekundér bisa rationalized ku pertimbangan struktural pikeun ngajaga tilepan atawa dipikawanoh sipat beungkeutan RNA.Sanajan kitu, penalaran ieu sigana teu dilarapkeun ka konservasi NNE, sarta saméméh ulikan ieu, alam konstrain nu ngawatesan variasi tina runtuyan tripeptida sagemblengna obscured.
Pikeun nangtukeun pentingna nsp9-NMPylation sareng konservasi NNE dina réplikasi coronavirus, kami ngahasilkeun mutan HCoV-229E, anu mawa substitusi tunggal atanapi ganda tina résidu nsp9 N-terminal, nunjukkeun yén nsp9 NMPylation ngabahayakeun sacara in vitro.Sateuacan urang ngamimitian, urang nyobian ngajawab patarosan naha substitusi ieu (deukeut situs pembelahan nsp8 | 9) mangaruhan pamrosésan proteolitik daérah pp1a terminal-C.Hiji set nsp7-11 polyprotein constructs ngandung substitusi saluyu dina N-terminus of nsp9 dihasilkeun dina E. coli sarta motong jeung rekombinan Mpro.Beulah proteolitik tina opat situs (kaasup situs flanking nsp9) henteu kapangaruhan sacara signifikan ku substitusi anu diwanohkeun (lampiran SI, Gambar S9), henteu kalebet parobahan struktural dina protéin ieu anu ngaganggu pembelahan nsp8|9 anu dimédiasi Mpro (Atawa anu sanésna) ramatloka.
Sél Huh-7 ditransfeksi ku RNA HCoV-229E panjang génom, ngodekeun substitusi Ala atanapi Ser dina tripéptida NNE anu dilestarikan (N3825, N3826, sareng E3827) di terminal nsp9 N, nunjukkeun yén kalolobaan mutasi téh fatal.Kami tiasa nyalametkeun virus ku cara ngagentos Ser atanapi Ala tina N-terminal Asn (N2835A atanapi N2835S), tapi gagal cageur virus sareng mutasi tunggal sareng ganda sanés dina sekuen NNE (N3826A, N3826S, NN3825 / 6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Gambar 5D).
Hasil ieu nunjukkeun yén réplikasi koronavirus dina kultur jaringan diwatesan (sarua atanapi sami), ngabatesan mutasi alami situs nsp9 NMPylation dina awak, sareng ngadukung peran konci réspon ieu dina siklus kahirupan koronavirus.
Dina set percobaan terakhir, kami ngahasilkeun C-terminal His6 dilabélan SARS-CoV-2 nsp12 sareng nsp9, sareng dua bentuk mutant nsp12 dina E. coli.Résidu situs aktip dina domain NiRAN sareng RdRp masing-masing anggo Ala (Gambar 6A sareng lampiran SI, Tabel S2).K4465 dina SARS-CoV-2 nsp12 saluyu sareng K4135 dina HCoV-229E (SI Appendix, Gambar S2), anu kabuktian diperyogikeun pikeun kagiatan NiRAN sareng réplikasi HCoV-229E (Gambar 3D sareng E).Résidu ieu ogé pakait sareng résidu virus EAV nsp9 K94 arterial, anu sateuacana ditingalikeun dipikabutuh pikeun NiRAN self-UMPylation / self-GMPylation (16).Sapertos dina Gambar 6B, SARS-CoV-2 nsp12 gaduh kagiatan transferase UMP nganggo nsp9 salaku substrat, sedengkeun mutan situs aktif nsp12_K4465A teu aktip.Substitusi ganda dina runtuyan karakteristik SDD RdRp motif C henteu mangaruhan aktivitas transferase UMP (Gambar 6B), nunjukkeun yén aktivitas RdRp euweuh pangaruh langsung dina nsp9 UMPylation.Data anu sami dicandak nganggo CTP, GTP sareng ATP (SI lampiran, Gambar S10).Kasimpulanna, data ieu nunjukkeun yén NSP9 NMPylation anu dimédiasi NiRAN gaduh kagiatan konservatif dina coronavirus anu ngagambarkeun genera anu béda tina subfamili orthocoronavirus.
SARS-CoV-2 nsp12-dimédiasi NMPylation of nsp9.(A) Coomassie patri SDS-polyacrylamide gél némbongkeun protéin rékombinan dipaké dina test NMPylation.Salaku kontrol, protéin mutan kalayan substitusi situs aktif dina domain NiRAN (K4465A) sareng domain RdRp (DD5152/3AA) tina SARS-CoV-2 nsp12 dianggo.Penomeran résidu dumasar kana posisi di pp1ab.(B) Autoradiograph of deteksi UMPylation maké nsp9-His6 jeung [α-32P] UTP salaku substrat nsp12-His6 (tipe liar [wt] jeung mutant).Massa molekular (dina kilodalton) tina protéin anu dilabélan dipidangkeun di kénca.
Domain NiRAN umumna dilestarikan dina Nidovirales (16), nunjukkeun yén aranjeunna ngatalisan réaksi énzimatik penting pikeun réplikasi Nidovirus.Dina ulikan ieu, urang bisa ngabuktikeun yén domain NiRAN tina coronavirus mindahkeun NMP (dihasilkeun tina NTP) ka nsp9, protéin RNA mengikat misterius aub dina réplikasi virus (26 ?? 29), pikeun nangtukeun salaku target alam jeung mitra tina coronavirus RTC.
Domain NiRAN ngabagi tilu motif runtuyan (AN, BN, sareng CN), anu ngandung sajumlah résidu anu sakedik pisan anu dilestarikan di sadaya kulawarga dina ordo Nidovirales monophyletic tapi béda pisan (8, 16).Panaliti anyar nunjukkeun yén aranjeunna sacara stuktur aya hubunganana sareng kulawarga anu henteu dicirian tina protéin sapertos kinase protéin, anu asalna disebut kulawarga SelO (17, 19, 22, 30, 31).Protéin anu aya hubunganana sareng SelO gaduh lipatan kinase, tapi kakurangan sababaraha résidu situs aktif anu dilestarikan dina kinase klasik (22, 32).Dumasar kana orientasi sabalikna molekul ATP kabeungkeut kana situs aktip tur stabilized ku interaksi husus, SelO ieu dihipotesiskeun sarta salajengna dikonfirmasi pikeun mindahkeun AMP (gaganti fosfat) kana substrat protéin (22), sedengkeun baktéri SelO-kawas protéin YdiU séjén boga. nembe geus ditémbongkeun ka ngatalisan kantétan kovalén UMP mun Tyr sarta résidu-Na substrat protéin béda (33).
Pikeun mastikeun sareng ngalegaan prediksi résidu situs aktip putative tina domain coronavirus NiRAN, kami nganggo metode genetik biokimia sareng sabalikna pikeun ngalakukeun analisa mutasi dina coronavirus nsp12 (Gambar 3D sareng E sareng SI lampiran, Gambar S3 sareng tabel) S1â S4).Data nunjukkeun yén ngagantian HCoV-229E K4135, R4178 sareng D4280 sareng Ala ngaleungitkeun kagiatan transferase NMP in vitro sareng réplikasi virus dina kultur sél (Gambar 3D sareng E sareng appendices SI, Gambar S3), ngadukung ayana di NTP γ-fosfat. (K4135, R4178) jeung koordinasi ion logam situs aktip (D4280).Substitusi E4145A tina Glu anu dilestarikan dina kisaran virus sarang manuk anu diprediksi bakal nyaimbangkeun posisi K4135 (17) ditingalikeun ngaleungitkeun réplikasi virus, tapi anu heran, kagiatan éta dipikagaduh dina assay NMPylation in vitro (Gambar 3D sareng E sareng SI lampiran, Gambar S3 Jeung Tabél S1–S4).A observasi sarupa dijieun nalika substitusi pakait diwanohkeun dina YdiU homolog of Salmonella typhimurium (E130A) (33).Dihijikeun, data ieu ngarojong fungsi pangaturan résidu konservasi ieu tinimbang fungsi katalitik.
Ngaganti résidu Phe (F4281A) anu dilestarikan dina kisaran nestovirus dina domain HCoV-229E NiRAN (8) nyababkeun panurunan dina kagiatan NMPylation in vitro sareng panurunan anu signifikan dina réplikasi virus dina kultur sél (Gambar 3D, E sareng SI) lampiran, Gambar S3).Datana konsisten sareng fungsi pangaturan penting tina résidu ieu, sapertos résidu Phe motif DFG homolog anu dipidangkeun saméméhna.Dina kinase protéin klasik, éta bagian tina loop beungkeutan Mg2 + tur mantuan pikeun ngumpul jeung ngatur tulang tonggong???Diperlukeun pikeun aktivitas katalitik éféktif (32, 34).Ngagantikeun Ala sareng Arg pikeun résidu K4116 (dina motif preAN), masing-masing ngaleungitkeun réplikasi virus sareng, sakumaha anu diharapkeun, gaduh pangaruh anu béda dina kagiatan transferase NMP in vitro, gumantung kana ranté samping asam amino anu diwanohkeun (Gambar 3D sareng E sareng appendices SI. , Gambar S3).Data fungsional saluyu sareng inpormasi struktural, nunjukkeun yén résidu ieu ngagaduhan interaksi sareng ATP fosfat (17).Dina domain NiRAN kulawarga virus nested séjén, posisi HCoV-229E pp1a / pp1ab K4116 dikawasaan ku Lys, Arg atanapi Na (8), nunjukkeun yén larangan fungsional résidu husus ieu geus santai.Substitusi D4188A sareng D4283A ngaleungitkeun atanapi ngirangan pisan kagiatan énzim sareng ngaleungitkeun réplikasi virus (Gambar 3).Dua résidu ieu dilestarikan dina sabagéan ageung (tapi henteu sadayana) virus bersarang (8), nunjukkeun fungsi khusus pikeun kulawarga tapi sigana henteu katalitik.Substitusi Ala sababaraha résidu Lys na Asp séjén (K4113A, D4180A, D4197A na D4273A) nu teu conserved di Coronaviridae atawa kulawarga Nestioviridae séjén (8) dipaké salaku kontrol.Saperti nu diharapkeun, substitusi ieu sakitu legana lumayan, kalawan saeutik panurunan dina aktivitas énzim jeung réplikasi viral dina sababaraha kasus (Gambar 3 jeung SI appendix, Gambar S3).Gemblengna, data mutagenesis coronavirus konsisten pisan sareng data GMP diri sareng data genetik sabalikna EAV NiRAN-RdRp (16), dimana EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) résidu K94 (cocog sareng HCoV- 229E K4135) fungsi penting), R124 (pakait jeung R4178), D132 (pakait jeung D4188), D165 (pakait jeung D4280), F166 (pakait jeung F4281).Salaku tambahan, data mutagenesis HCoV-229E konsisten sareng sareng dilegaan tina data genetika sabalikna SARS-CoV anu dilaporkeun samemehna (16), sami sareng anu dititénan pikeun motif CN anu pakait Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The phenotype digambarkeun -F219A na HCoV-229E_F4281A (Gambar 3 D jeung E jeung SI appendix, Gambar S3 jeung Table S1-S4).
Dibandingkeun sareng ortolog EAV (16), anu gaduh karesep anu jelas pikeun UTP sareng GTP (dina réaksi NMPylation diri), panilitian kami nunjukkeun yén domain coronavirus NiRAN (diwakilan ku HCoV-229E sareng SARS-CoV-2) tiasa efektif. ditransfer Sadaya opat NMP, sanajan aya hiji leuwih sering dipake tinimbang slight pikeun UMP (angka 1 jeung 3).Spésifisitas rélatif rendah tina ko-substrat NTP spésifik konsisten sareng struktur superkomposit SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 anu nembé dilaporkeun, dimana ADP-Mg2+ ngiket kana situs aktif NiRAN, tapi henteu sareng adénin Bagian. tina formasi interaksi husus (17).Dina ulikan urang, tipe nukléotida dipaké dina réaksi NMPylation teu boga pangaruh diferensial kana aktivitas protéin mutant (SI Appendix, Gambar S3), nunjukkeun yén euweuh résidu ieu raket patalina jeung beungkeutan nucleobase husus.Dasar struktural sareng poténsi significance biologis tina preferensi ko-substrat NTP anu béda anu dititénan dina domain NiRAN coronaviruses sareng virus arteri tetep ditaliti;bisa jadi bener atawa bisa jadi alatan katerbatasan studi masing-masing.Ayeuna, teu tiasa diputuskeun yén kagiatan NMPylator poténsial tina domain NiRAN virus arterial (dibandingkeun sareng kagiatan NMPylation diri anu dicirian saméméhna) gaduh préferénsi ko-substrat anu béda, kalayan nganggap yén kamiripan antara arteri sareng coronavirus. domain NiRAN aya dina watesna.Dumasar runtuyan Bandingkeun (16).Dibandingkeun sareng pseudokinase SelO, anu ngagunakeun Mg2+ salaku kofaktor, kagiatan koronavirus sareng virus arteri NiRAN gumantung kana Mn2+ (16) (Gambar 3C sareng lampiran SI, Gambar S1).Katergantungan Mn2 + sareng karesep anu jelas pikeun UTP mangrupikeun fitur anu teu biasa tina NMPylators protéin, sareng nembé dikonfirmasi dina protéin YdiU tina Salmonella typhimurium, anu ngatalisan UMPylation chaperone protéin anu gumantung Mn2 + anu ketat pikeun nangtayungan sél tina induksi setrés Cell ATP pool ( 33).
Kasaruaan struktural anu nembé dijelaskeun antara domain coronavirus NiRAN sareng kinase protéin sélulér (17, 19) nyayogikeun dukungan tambahan pikeun kamampuan NiRAN pikeun nyambungkeun kovalén NMP kana protéin anu sanés anu kami laporkeun dina ulikan ieu.Kami museurkeun milarian kamungkinan target NiRAN dina protéin anu disandi ku HCoV-229E ORF1a, anu dipikanyaho sacara langsung atanapi henteu langsung ngabantosan réplika RTC's ORF1b-encoded (12, 35).Percobaan kami nyadiakeun bukti nu ngayakinkeun pikeun NMPylation éféktif jeung husus tina nsp9 (Gambar 2).Upami protéin target dianggo dina kaleuwihan molar anu 8 dugi ka 10 kali langkung luhur tibatan énzim (nsp12), dikonfirmasi yén nsp9 lengkep (mono) NMPized (Gambar 4).Kami nyimpulkeun yén interaksi antara nsp12 sareng nsp9 sakedap sareng moal ngabentuk kompleks anu stabil sareng nsp9 (dina henteuna subunit RTC anu sanés).Kacindekan ieu dirojong ku studi interaksi protéin dina proteome SARS-CoV (35).Analisis MS dicirikeun amina primér résidu N-terminal tina nsp9 salaku situs NMPylation (SI lampiran, Gambar S5).Pembentukan beungkeut fosforamidat sareng gugus amino terminal-N ngabédakeun kagiatan NMPylasi anu dimédiasi NiRAN sareng réaksi AMPilasi anu dimédiasi Pseudomonas syringae SelO, anu ngatalisan formasi AMP anu dihubungkeun O dina séri Ser, Thr, atanapi Tyr résidu péptida adduct ( 22), sarta S. typhimurium YdiU ngabentuk O-numbu (jeung Tyr) jeung N-numbu (jeung Na) péptida-UMP adducts.Inpormasi kawates anu aya dina kulawarga protéin SelO nunjukkeun yén anggota kulawarga protéin ageung ieu béda pisan dina formasi aduk péptida-NMP.Ieu observasi metot nu pantes ulikan salajengna.
Data diala dina ulikan ieu ngarah urang ka hypothesize yén NMPylation of nsp9 merlukeun N-terminus bébas.Dina kontéks réplikasi virus, ieu bakal disayogikeun ku pembelahan proteolitik tina situs pangolahan nsp8|nsp9 dina réplika poliprotein pp1a anu dimédiasi ku Mpro sareng pp1ab.Dina kalolobaan koronavirus, bédana antara situs khusus ieu (VKLQ|NNEI dina HCoV-229E) sareng sadaya situs pembelahan Mpro coronavirus sanés nyaéta Asn (tinimbang résidu leutik sanés, sapertos Ala, Ser Or Gly) nempatan P1â???Lokasi (36).Data pembelahan péptida anu dicandak dina panilitian awal nunjukkeun yén efisiensi pembelahan situs nsp8|nsp9 langkung handap tina situs-situs sanés, nunjukkeun yén 1) situs khusus ieu tiasa gaduh peran pangaturan dina pamrosésan koordinasi C-terminal tepat waktu. wewengkon pp1a, atawa 2) a Peran tina nsp9 N-terminus konservasi husus dina réplikasi virus (37).Data urang (Gambar 5A) némbongkeun yén bentuk rékombinan nsp9 mawa runtuyan N-terminal nyata ieu éféktif NMPized ku nsp12.Runtuyan flanking N-terminal dihapus ku faktor Xa (nsp9-His6; SI appendix, Table S1) atawa Mpro-dimédiasi meulah (nsp7-11-His6; Gambar 5A jeung SI lampiran, Table S1).Anu penting, prékursor nsp9 anu henteu dipotong nsp7-11-His6 nunjukkeun résistansi kana NMPylation of nsp12, anu konsisten sareng data urang, nunjukkeun yén adduct nsp9-NMP kabentuk ngaliwatan amina primér N-terminal (SI lampiran, Gambar S5) .Pikeun kéngingkeun pamahaman anu langkung jero ngeunaan spésifisitas substrat NiRAN, urang teras difokuskeun kana résidu N-terminal anu padeukeut tina nsp9.Dina henteuna protéin anu sanés, aranjeunna sacara struktural fleksibel, nyegah aranjeunna dideteksi dina bentuk nsp9 anu teu dilabélan (26 28, 38), nunjukkeun variasi alami anu terbatas. fungsi fragmén nsp9 N-terminal.Panggantian résidu anu dilestarikan di daérah ieu (Gambar 5C sareng D sareng lampiran SI, Gambar S8) nunjukkeun yén N3826 penting pisan pikeun nsp9 NMPylation in vitro, sedengkeun substitusi N3825A sareng E3827A nyababkeun panurunan dina panggantian M3829A sareng P3830A. .Jelas mangaruhan nsp9 NMPylation.Sanajan substitusi N-terminal Asn (N3825A, N3825S) ngan boga pangaruh sedeng on nsp9 NMPylation jeung réplikasi virus dina kultur sél (Gambar 5C jeung D), ngahapus runtuyan résidu Asn tina N-terminal 3825-NN dipéptida. kabuktian Éta bisa nepi ka tiwasna pikeun virus, nunjukkeun yén hiji résidu Asn diperlukeun saméméh résidu sejen di N-terminus, preferably Asn, sanajan sigana substitusi résidu sarupa bisa ditolerir sawaréh (Gambar 5B, C, jeung D).Kami nyimpulkeun yén dipeptida 3825-NN, khususna résidu N3826 anu dilestarikan sareng penting dina kisaran koronavirus (lampiran SI, Gambar S6), mastikeun beungkeutan sareng orientasi anu leres tina nsp9 N-terminus dina situs aktif NiRAN.
Ngagantikeun Ala (E3827A) pikeun Glu anu dilestarikan sadaya subfamili nahan nsp9 NMPylation in vitro tapi bisa nepi ka tiwasna pikeun virus dina kultur sél (Gambar 5C jeung D), nunjukkeun fungsi tambahan résidu ieu, contona, dina interaksi konci (NMPylated atanapi unmodified). ) nsp9 N-terminus jeung faktor séjén aub dina réplikasi virus.Mutasi Nsp9 henteu mangaruhan prosés proteolitik nsp9 atanapi nsps anu padeukeut (39) (SI Appendix, Gambar S9), nunjukkeun yén fénotip maot tina sababaraha mutasi nsp9 anu dititénan henteu disababkeun ku disregulasi daérah pp1a terminal prosés proteolitik C. .
Data di luhur nyadiakeun bukti yén sanggeus perlakuan Mpro-dimédiasi tina nsp8|9 situs pembelahan di pp1a/pp1ab, N-terminus nsp9 bisa UMPylated (atawa sawaréh dirobah kalawan NMP sejen).Sajaba ti éta, konservasi alus teuing tina N-terminus of nsp9 (kaasup résidu Asn tunggal jeung invarian dina kulawarga coronavirus) jeung data genetik sabalikna diala dina ulikan ieu (Angka 3E jeung 5D) ngarah urang nyimpulkeun yén nsp9 NMPylation digambarkeun. aya hubunganana sacara biologis sareng penting pikeun réplikasi coronavirus.Konsékuansi fungsional modifikasi ieu tetep ditalungtik, contona, ngeunaan nsp9 (non-spésifik) nu dijelaskeun saméméhna (formulir unmodified) aktivitas RNA mengikat (2628).N-terminal NMPylation ogé tiasa mangaruhan interaksi nsp9 sareng protéin atanapi substrat RNA atanapi formasi rakitan opat tingkat anu béda.Ieu parantos dititénan dina studi struktural sareng parantos dikonfirmasi sacara fungsional aya hubunganana sareng réplikasi coronavirus, sanaos upami henteuna Dina kasus modifikasi ieu (26- ââ29, 40).
Sanaos spésifisitas target domain NiRAN coronavirus masih kedah dicirian sacara langkung rinci, data kami nunjukkeun yén spésifisitas target protéin tina domain coronavirus NiRAN sempit pisan.Sanajan konservasi résidu situs aktif konci (8, 16) dina domain NiRAN sadaya kulawarga nidovirus ngarojong pisan aktivitas nu konservasi NMPylator protéin ieu, identitas résidu saku ngariung substrat tina domain ieu Konservasi sarta konservasi tetep jadi dicirikeun. , sarta bisa jadi béda antara kulawarga béda tujuan Nidovirales.Nya kitu, udagan anu sasuai pikeun virus bersarang anu sanés henteu acan ditangtukeun.Éta bisa jadi ortolog jauh tina nsp9 atawa protéin séjén, sabab runtuyan di luar lima domain réplika nu umumna dilestarikan dina virus nested kurang dilestarikan (8), kaasup susunan génom antara Mpro jeung NiRAN, Di antarana, nsp9 lokasina di virus corona.
Salaku tambahan, urang ayeuna teu tiasa ngaluarkeun kamungkinan yén domain NiRAN ngagaduhan target tambahan (kaasup sélular).Dina hal ieu, éta patut mentioning yén homologues baktéri dina ieu munculna NMPylators protéin (NMPylators) (30, 31) sigana boga "régulator master"?NMP modulates rupa-rupa protéin sélular pikeun ngatur atawa ngaleungitkeun kagiatan hilir maranéhanana, kukituna maénkeun peran dina rupa-rupa prosés biologis, kayaning respon stress sélular jeung homeostasis rédoks (22, 33).
Dina ulikan ieu (Gambar 2 jeung 4 jeung Appendix SI, Gambar S3 jeung S5), urang bisa ngabuktikeun yén nsp12 mindahkeun bagian UMP (NMP) ka posisi tunggal (konservasi) dina nsp9, sedengkeun protéin séjén teu dirobah dina dipaké Dina kaayaan, well-diartikeun (tinimbang leupas) spésifisitas substrat dirojong.Konsisten jeung ieu, dibandingkeun jeung N-terminal nsp9 NMPylation, aktivitas NMPylation nsp12 urang sorangan pisan low, deteksi na merlukeun waktu paparan autoradiography leuwih panjang, sarta kanaékan 10 kali ganda dina konsentrasi nsp12 dipaké.Salaku tambahan, analisa MS kami gagal nyayogikeun bukti pikeun NMPylation of nsp12, anu nunjukkeun yén domain NiRAN self-NMPylation mangrupikeun (paling saé) kagiatan sekundér.Sanajan kitu, éta kudu dicatet yén studi lianna geus nyadiakeun bukti awal yén status timer AMPylation of NMPylator baktéri bisa ngadalikeun aktivitas NMPylation maranéhanana dina substrat protéin lianna (22, 33).Ku alatan éta, panalungtikan leuwih diperlukeun pikeun nalungtik épék fungsional mungkin tina kagiatan NMPylation diri dilaporkeun pikeun EAV nsp9 (16) jeung coronavirus nsp12 (ulikan ieu), kaasup pangaruh chaperone-kawas diusulkeun dina tilepan tina domain RdRp terminal C ( 16)).
Saméméhna, sababaraha hipotesis ngeunaan kamungkinan fungsi hilir tina domain nidoviral NiRAN geus dianggap, kaasup RNA ligase, RNA -capped guanylate transferase sarta aktivitas protéin priming (16), tapi taya sahijina anu cocog jeung fungsi hilir sadia.Inpormasi anu dicandak dina posisi di handap ieu persis waktos anu sami tanpa ngadamel asumsi tambahan.Data diala dina ulikan ieu paling konsisten jeung (tapi teu bisa ngabuktikeun) yén domain NiRAN kalibet dina inisiasi sintésis RNA protéin-ngainduksi.Ieu saméméhna dipercaya yén fungsi domain NiRAN dina 5 ??²-RNA capping atawa réaksi ligation RNA teu kapangaruhan ku ieu jeung Rojongan data séjén.Ku sabab kitu, contona, situs aktif NiRAN dianggap ngalibetkeun Asp anu dilestarikan salaku basa umum (D252 dina Pseudomonas syringae SelO; D4271 dina HCoV-229E pp1ab; D208 dina SARS-CoV-2 nsp12) (SI Appendix, gambar 2). ).S2) (17, 22, 33), sedengkeun katalisis dina ligase RNA gumantung ATP sareng énzim capping RNA dilaksanakeun ku perantara énzim kovalén-(lysyl-N)-NMP, anu ngalibatkeun résidu Lys non-Robah ( 41).Salaku tambahan, spésifisitas dumasar-urutan anu luar biasa tina coronavirus NiRAN pikeun target protéin anu dilestarikan sareng spésifisitas santai pikeun ko-substrat NTP (resep UTP) ngalawan énzim capping anu dimédiasi NiRAN atanapi fungsi sapertos ligase RNA.
Jelas, seueur padamelan tambahan anu diperyogikeun pikeun pariksa sareng, upami kabuktian, ngajelaskeun kamungkinan peran nsp9-UMP (nsp9-NMP) dina sintésis RNA anu ngainduksi protéin, anu bakal nyambungkeun sababaraha laporan anu pikaresepeun tapi (sajauh ieu) dilaporkeun saméméhna. .Observasi terasing.Salaku conto, parantos ditangtukeun yén tungtung RNA untaian négatip tina coronavirus dimimitian ku untaian oligo(U) (42, 43).Observasi ieu saluyu sareng pamanggih yén sintésis RNA untaian-négatip dimimitian ku ngariung bentuk UMPylated of nsp9 kana buntut poli(A) ( pemicu), anu tiasa dipromosikeun ku RNA na ngariung Aktivitas sareng / atanapi interaksi sareng protéin RTC sejen.Bagian UMP disadiakeun ku nsp9 lajeng bisa dipaké salaku "primer" pikeun nsp7/8/nsp12-dimédiasi oligouridylation, ngagunakeun 3??²-poly(A) buntut dina RNA génomik atawa oligo séjén (A) -containing runtuyan. fungsina salaku citakan, sarupa jeung mékanisme ngadegkeun pikeun protéin picornavirus VPg (44).Kumaha upami proposalna "non-normatif"????Inisiasi sintésis RNA untaian-négatip (ngainduksi protéin) nyayogikeun tautan kana observasi, nunjukkeun yén RNA untaian-négatip koronavirus ngagaduhan UMP (gaganti UTP) dina tungtung (42), anu dianggap nunjukkeun yén asam nukléat Dicer meulah tungtung fosforilasi ku endonuclease husus uridin kanyahoan.Upami dikonfirmasi, kagiatan hidrolitik asam nukléat ieu tiasa ngabantosan ngabebaskeun bentuk oligomérik UMPylated nsp9 tina tungtung 5 ² tina untaian négatip nascent.Peran mungkin tina nsp9 dina priming protéin ogé konsisten sareng studi genetika ngabalikkeun saméméhna, anu nunjukkeun yén nsp9 (sareng nsp8) berinteraksi sacara kritis sareng khusus sareng unsur RNA akting cis anu dilestarikan caket tungtung 3 tina génom coronavirus.45).Numutkeun laporan ieu, observasi saméméhna ieu ayeuna bisa ditalungtik deui jeung dimekarkeun ngaliwatan panalungtikan salajengna.
Kasimpulanana, data kami nangtukeun kagiatan husus tina tag énzim virus nested proprietary numbu ka RdRp di N-terminus.Dina coronavirus, kagiatan UMPylator/NMPylator anu dimédiasi NiRAN anu nembé kapendak ieu dianggo pikeun ngandelkeun Mn2+ sareng résidu Asn anu padeukeut sareng nyababkeun kabentukna beungkeut fosforamidat (énergi rendah) sareng amina primér terminal-N.Ngaliwatan pembelahan anu dimédiasi Mpro di situs pembelahan nsp8|9, target nsp9 tiasa dianggo pikeun NMPylation, nunjukkeun gandeng fungsional antara protease sareng domain NiRAN, anu dugi ka RdRp.Konservasi résidu konci dina situs aktip nsp12 NiRAN sareng target nsp9, digabungkeun sareng data anu dicandak tina dua coronavirus kalebet SARS-CoV-2, nyayogikeun bukti kuat yén nsp9 NMPylation mangrupikeun coronavirus Fitur konservatif ogé mangrupikeun léngkah konci dina réplikasi virus.Data anu sayogi nyababkeun urang nyimpulkeun yén peran spésifik bentuk NMPylated of nsp9 dina sintésis RNA ngainduksi protéin nyaéta skenario anu lumrah pikeun coronavirus sareng virus nested anu sanés, sareng NiRAN ogé tiasa nargétkeun protéin anu teu dipikanyaho.Ngatur virus.Interaksi host.Upami dikonfirmasi, keterlibatan primer protéin dina sintésis RNA virus bakal ningkatkeun urutan afinitas domain Mpro/3CLpro sareng RdRp antara coronavirus anu dideteksi sateuacana sareng supergrup sapertos picornavirus (9), anu ayeuna parantos ngahiji dina Pisonivirites anu nembé diadegkeun ( 46) dina kategori.
Data kami ogé nunjukkeun yén kagiatan énzim dasar, selektif sareng konservatif anu diidentipikasi dina ulikan ieu tiasa dianggo salaku udagan pikeun ubar antiviral.Sanyawa anu ngaganggu beungkeutan (sareng modifikasi salajengna) tina nsp9 N-terminus anu dilestarikan dina situs aktif NiRAN tiasa dikembangkeun janten ubar antiviral anu efektif sareng serbaguna, cocog pikeun pengobatan koronavirus sato sareng manusa tina Inféksi (sub)genus anu béda. , kalebet SARS-CoV-2 sareng Sindrom Pernafasan Wétan Tengah Coronavirus.
Runtuyan coding protéin coronavirus anu dihasilkeun dina ulikan ieu diamplifikasi ku RT-PCR ngagunakeun RNA diisolasi tina Huh-7 kainfeksi HCoV-229E atanapi Vero E6 kainfeksi SARS-CoV-2, sareng diselapkeun nganggo prosedur kloning standar.pMAL-c2 (Laboratorium Biologi New England) atanapi pASK3-Ub-CHis6 (47) vektor ekspresi (SI Appendix, Tabél S1 jeung S2).Substitusi kodon tunggal diwanohkeun ku mutagenesis diarahkeun situs dumasar PCR (48).Pikeun ngahasilkeun protéin fusi MBP, sél E. coli TB1 ditransformasikeun ku konstruksi plasmid pMAL-c2 anu luyu (lampiran SI, Tabel S1).Protéin fusi dimurnikeun ku kromatografi afinitas amilosa sareng dibeulah ku faktor Xa.Salajengna, protéin C-terminal His6-tagged dimurnikeun ku kromatografi pangirut logam Ni-immobilized (Ni-IMAC) sakumaha ditétélakeun saméméhna (49).Pikeun ngahasilkeun protéin fusi ubiquitin, sél E. coli TB1 ngagunakeun konstruksi plasmid pASK3-Ub-CHis6 (SI Appendix, Tables S1 jeung S2) jeung pCGI plasmid DNA encoding ubiquitin-spésifik C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Transformasi (47).Protéin koronavirus anu ditandaan C-terminal His6 dimurnikeun sapertos anu dijelaskeun sateuacana (50).
Uji NMPylation diri HCoV-229E nsp12-His6 dilaksanakeun sakumaha anu dijelaskeun dina EAV nsp9 (16).Pondokna, nsp12-His6 (0.5 µM) ngandung 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM panyangga NTP sareng 0,17 µM anu ditangtukeun cocog sareng [α32-P] NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) dina suhu 30 °C salami 30 menit.Dina sadaya tés NMPylation (standar) séjén tina nsp12-dimédiasi nsp9 NMPylation, kaayaan réaksina disaluyukeun kieu: nsp12-His6 (0.05 µM) jeung nsp9-His6 (4 µM) ku ayana 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM dituduhkeun NTP, jeung 0,17 µM cocog [α32-P]NTP.Saatos inkubasi salila 10 menit dina 30 ° C, sampel réaksi ieu dicampurkeun jeung panyangga sampel SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hidroksimétil)aminometana HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% gliserol jeung 0,005% bromophenol. biru.Protéin didenaturasi ku pemanasan dina 90 ° C salila 5 menit sarta dipisahkeun ku 12% SDS-PAGE.Gélna dilereskeun sareng diwarnaan ku solusi Coomassie Brilliant Blue (40% métanol, 10% asam asétat, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), diwarnaan, sareng kakeunaan layar pencitraan phosphorescent salami 20 jam (pikeun ngadeteksi nsp12 tina NMPylation) atawa (maksimum) 2 Jam (pikeun assess nsp9 NMPylation).Imager Typhoon 9200 (GE Healthcare) dianggo pikeun nyeken layar sareng ImageJ dianggo pikeun nganalisis inténsitas sinyal.
Pikeun analisis MS, 1 µM nsp12-His6 jeung 10 µM nsp9 (tanpa tag hexahistidine) dipaké dina analisis NMPylation (SI appendix, Table S1) jeung ngaronjat konsentrasi 500 µM UTP jeung GTP dipaké.Gumantung kana konsentrasi sareng kualitas protéin anu dipiharep, sistem HPLC Waters ACQUITY H-Class anu dilengkepan kolom MassPrep (Waters) dianggo pikeun nyalurkeun 1 dugi ka 10 µL solusi protéin buffered online.Protéin desalted diélusi kana sumber ion electrospray tina Synapt G2Si spéktrométer massa (Waters) ngaliwatan gradién handap panyangga A (cai/0,05% asam format) jeung panyangga B (acetonitrile/0,045% asam format), sarta suhu kolom nyaéta 60 ° C sareng laju aliran 0,1 mL / mnt: élusi isocratically sareng 5% A salami 2 menit, teras gradién linier ka 95% B dina 8 menit, sareng ngajaga 95% B salami 4 menit deui.
Ion positip kalayan rentang massa 500 nepi ka 5000 m/z dideteksi.Glu-fibrinopeptide B diukur unggal 45 detik pikeun koreksi drift massa otomatis.Anggo parangkat lunak instrumen MassLynx sareng ekstensi MaxEnt1 pikeun ngarobih spéktrum rata-rata saatos ngirangan garis dasar sareng lemes.
UMPylated HCoV-229E nsp9 dicerna ku cara nambahkeun trypsin (Serva) anu dirobih kelas urutan sareng diinkubasi sapeuting dina suhu 37 °C.Kolom spin Chromabond C18WP (nomer bagian 730522; Macherey-Nagel) dianggo pikeun nyéépkeun uyah sareng konsentrasi péptida.Tungtungna, péptida ieu leyur dina 25 µL cai, nu ngandung 5% acetonitrile jeung 0,1% asam format.
Sampel dianalisis ku MS ngagunakeun spéktrométer massa Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Sistim HPLC nanoâ pamungkas (Dionex), dilengkepan custom tungtung-dipasang 50 cm ??75 μm C18 RP kolom dipak kalawan 2,4 μm manik magnét (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Nyambung ka spéktrométer massa online ngaliwatan sumber Proxeon nanospray;nyuntikkan 6 µL larutan pencernaan tripsin ke dalam diameter dalam 300 µm ×??1 cm C18 Kolom pra-konsentrasi PepMap (Thermo Scientific).Ngagunakeun cai/0,05% asam format salaku pangleyur, sampel ieu otomatis trapped tur desalinated dina laju aliran 6 µL / mnt.
Gradién handap cai/0,05% asam format (pangleyur A) jeung 80% asetonitril/0,045% asam format (pangleyur B) dipaké pikeun ngahontal pamisahan péptida tryptic dina laju aliran 300 nL / mnt: 4% B pikeun 5 menit, lajeng 30 A gradién linier ka 45% B dina menit, sarta kanaékan linier ka 95% pangleyur B dina 5 menit.Sambungkeun kolom kromatografi ka stainless steel nano-emitter (Proxeon), sarta nyemprot eluent langsung ka kapilér dipanaskeun spéktrométer massa ngagunakeun poténsi 2.300 V. Survey scan kalawan resolusi 60.000 dina Orbitrap analyzer massa pakait. kalawan sahenteuna tilu data MS / MS scan, dinamis kaasup pikeun 30 detik, ngagunakeun ion bubu tabrakan ngainduksi disosiasi atawa luhur tabrakan énergi disosiasi digabungkeun jeung deteksi orbitrap , Resolusi nyaeta 7.500.
waktos pos: Aug-03-2021